徠卡顯微鏡：熒光簡介
熒光是由喬治·加布里埃爾·斯托克斯在1852年首次被發現⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。他指出⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，螢石開始發光后㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，用紫外光照射㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。 熒光是一種形式的⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，它描述了由輻射產生的光子的材料被光照射后的光致發光㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。 所發射的光具有比激發光的波長較長的웃유ღ♋♂。 這種效應被稱為 斯托克斯位移（Stokes shift）ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。
作為一種工具⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，熒光顯微鏡
被廣泛用于熒光顯微鏡觀察特定的分子的分布的一個重要工具㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。 大多數細胞中的分子不發出熒光ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。 因此⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，他們被稱為熒光染料的熒光分子標記⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 可以直接標記的感興趣的分子（例如DNA用DAPI）⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，或者它們可以被耦合到特異性抗體的免疫染色的熒光染料❣❦❧♡۵。 通常是固定的細胞所必需的免疫染色ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。
熒光顯微鏡也允許時間推移成像活細胞或組織❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 為了這個目的可以被標記蛋白質的利益☾☽❄☃，如GFP（綠色熒光的蛋白）基因編碼的熒光分子㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。 感興趣的分子（例如鈣 2 + ）✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，也可以使用可逆地結合合成染料（例如❣❦❧♡۵，呋喃-2）或遺傳修飾的天然存在的蛋白質（如GFP的衍生物）標簽ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。
電子的能量狀態的變化導致發光
發光描述一個電子從激發態到較低的能量的狀態下的變化所造成的發光效應的發生㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。 電子可以存在于不同的能量狀態⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。 電子的基態是一個非常穩定的狀態♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，并具有最低的能量水平ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 如果電子吸收能量時☈⊙☉℃℉❅，它們可以被提升到一個更高的能量水平①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，提供一個激發態ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。 由于更高的能量比基態激發態ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，能量被釋放時返回它的基態電子☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。 這種能量可以釋放的形式發射光子⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。
有幾種形式不同的方式㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，系統被激發♀☿☼☀☁☂☄，例如☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，在電致發光系統通過電流激發發光✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，化學發光的發生是由于發生化學反應而從通過光子激發的光致發光的結果㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。
可以進一步分成兩個小組♀☿☼☀☁☂☄，熒光和磷光的光致發光⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。 熒光和磷光之間的主要區別是其發光的持續時間❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。 熒光照明停止時立即結束㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。與此相反㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，磷光可以持續幾個小時后的激發已經結束❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
圖 1：當使用一定波長的光（激發波長）的光子被吸收的分子的電子擊中的分子（例如熒光團）⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。 然后⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，電子被從它們的基態（S 0 ）提升到一個更高的能量水平♀☿☼☀☁☂☄，激發態（S 1 '）ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。這個過程被稱為激勵（1）✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。 激發態壽命很短（通常為10 -9 -10 -8 秒）ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，在這段時間（2）的電子的能量損失✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 當電子離開（ 1 ） 激發態 返回到基態（3）웃유ღ♋♂，他們失去了在激勵過程中采取了剩余的能量⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。 在熒光基團的情況下ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，能量被發射的光（熒光發射）的較長波長比激發光（并因此使用更少的能源）ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 這種現象被稱為斯托克斯移位㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。
熒光的機理
熒光染料的熒光是當它們存在對應的波長的光照射♀☿☼☀☁☂☄。 的波長取決于熒光團的吸收光譜☈⊙☉℃℉❅，它必須確保合適數量的能量被傳遞到提升到激發態的電子⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。 后電子被激發✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，它們可以駐留在這種高能量的狀態下☾☽❄☃，只有很短的時間①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。 當電子放寬到基態或其他國家具有較低的能量水平⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，釋放能量❣❦❧♡۵，作為一個光子ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。 在此過程中由于一些能量丟失㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，增加的波長和能量較低的光由熒光染料相比♀☿☼☀☁☂☄，所吸收的光的發射웃유ღ♋♂。
圖 2：COS 7細胞㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，綠色：未知的蛋白㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，綠色熒光蛋白⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，紅色：α-微管蛋白✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，CY3✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，藍：細胞核⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，DAPI☈⊙☉℃℉❅。 禮貌的卞偉教授ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，細胞研究中心研究院生物化學與細胞生物學研究所⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，上海生命科學研究院①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，中科院㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，上海♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，中國
圖 3：小鼠成纖維細胞☈⊙☉℃℉❅，綠色：F-肌動蛋白❣❦❧♡۵，FITC紅：微管蛋白ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，CY5⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，藍核⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，DAPIⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 由君特·吉斯博士⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，醫學研究的馬克斯普朗克研究所ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，海德堡ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，德國
圖 4：小鼠海馬神經元❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，藍標記的轉染細胞ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，綠色：肌動蛋白✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，TRITCⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，紅色：紅色ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，灰色✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，德州GluA AMPA受體單元：突觸囊泡蛋白웃유ღ♋♂，CY 5
圖 5：果蠅幼蟲ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，綠色：RNA結合蛋白㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，Alexa的488
磷光的機理
由于磷光的分子可以更長的時間比熒光染料的發光㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，就必須有一個不同的方式中✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，它們存儲激發能量㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。 這種差異的基礎上웃유ღ♋♂，發現在兩種形式的激勵水平☈⊙☉℃℉❅，單線激發態和激發三重態ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，這是基于對不同自旋對齊웃유ღ♋♂。
自旋電子的屬性ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 以簡化的術語的自旋描述的電子通過其旋轉造成的角動量ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 一個電子的自旋的方向可以是正的（1/2）或負（-1 / 2）ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 自旋對較高的能量水平可以是在它們的方向彼此平行或反平行⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。 在反平行自旋對個別的角動量相互補償❣❦❧♡۵，總自旋得到的值為零☾☽❄☃。 這被稱為自旋排列單線態⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 兩個平行的旋轉不補償㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，并得到一個非零的值①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。 在這種情況下☈⊙☉℃℉❅，自旋被說成是在三重狀態☾☽❄☃。
熒光發生當電子從單線激發態回到基態㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。 但在某些分子❣❦❧♡۵，被激發的電子的自旋可以切換到在這個過程被稱為系統間橫穿三重態①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。 這些電子失去能量웃유ღ♋♂，直到他們在三重態♀☿☼☀☁☂☄。 此狀態是更高的能量比基態✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，但也比單線激發態能量較低✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 因此♀☿☼☀☁☂☄，電子無法切換回單狀態⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，也不是他們可以輕松地返回到基態❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，總自旋允許值為零⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，由于量子力學⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。 因此❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，這些分子都被困在他們的能量狀態☾☽❄☃。
但是ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，來自三重態到基態的一些變化是可能的時間☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。 這些變化會引起輻射產生的光子和磷光ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 由于只有少數事件是可能的時間✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，三重態呈現一種能源水庫⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，使磷光可能在一個較長的時間段☾☽❄☃。
熒光顯微鏡
顯微鏡㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，熒光發光是最有用的一種☈⊙☉℃℉❅。 可以很容易地與他們的特定波長通過特定的光源（例如燈和過濾系統或激光）可區別于所發射的光的激發光的波長（斯托克斯移位）激發熒光染料☈⊙☉℃℉❅。
使用熒光成像⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，實驗者可以表征分子在細胞內的量和本地化✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。 熒光顯微鏡的另一個優點是ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，可以同時使用多個熒光染料❣❦❧♡۵。 的熒光染料只需要在他們的激發和發射波長變化❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 因此❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，可以同時觀察到不同的目標分子①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，允許一個巨大的各種試驗㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，例如☾☽❄☃，以進行共定位研究❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。