徠卡顯微鏡寬視場超分辨率與GSDIM
在生物學巨大進步已經能夠通過使用熒光顯微鏡✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 到目前為止⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，圖像的分辨率由于物理限制的限制❣❦❧♡۵。 在過去的幾年中①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，新的發展方式規避這些限制⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，并把熒光顯微鏡分辨率的一個新的水平ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，提高準備在科學熒光顯微鏡ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 基態耗盡其次是個別分子回報 （GSDIM）是一個本地化的顯微技術✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。 該技術是能夠解決細節小至20納米 ㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。 這使得單一的蛋白質結構和生物分子在細胞研究和觀察分子過程✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。 之一的GSDIM方法比其它定位技術的主要優點是⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，它可以用在生物醫學研究中常規應用的標準熒光標記被使用♀☿☼☀☁☂☄。
定位顯微鏡
常規熒光顯微鏡圖像的分辨率由衍射到所發射的光的約一半的波長的限制✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 分離被緊密聯系起來的溶液是需要克服阿貝衍射極限熒光標記的結構ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。 *常見的*分辨方法♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，成像*越衍射極限的定位顯微鏡ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，SIM（結構照明）和STED（受激發射損耗顯微鏡）ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。
基態耗盡之后個別分子回報（GSDIM）是一個本地化的顯微技術ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 在一般情況下❣❦❧♡۵，定位顯微鏡不看的同時發光熒光合奏❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，但清楚地分開⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，單獨的熒光團可與納米精度進行本地化⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。 隨著時間的推移ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，各熒光團標記的生物結構的位置被確定⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，并且基于每個熒光團的位置信息的圖像被重新構造⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，在硅片⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 面臨的挑戰是有效地單數的熒光團的合奏⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，以允許單分子檢測❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
GSDIM - 分子基礎
在GSDIM關鍵的一步是暫時切換大多數熒光團關閉⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，允許單個熒光團的精確定位❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。 為此웃유ღ♋♂，高強度的激發光被用于在該樣品中✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，幾乎所有熒光團變成暗這樣的方式ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，只留下單一的⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，分離良好的熒光團發出熒光❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，這是納米精度定位的先決條件⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。
圖1（右）：基于簡化雅布隆斯基圖上的GSDIM方法的示意圖⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。 在熒光團離域π電子可以是ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，例如⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，在地面狀態S 0>☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，處于興奮狀態S 1（兩個所謂的導通狀態）㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，或在一個三重或自由基暗狀態（均為OFF狀態）ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 當熒光燈被發射時⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，電子在地面和激發態之間循環ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。 不同于這些ON狀態㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，在OFF狀態下的熒光團不能發光❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 這些斷狀態通常是長壽命的⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，但它們是難以實現ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，作為一個系統間交叉是必需的❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 通過設置合適的環境條件下✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，在包埋介質❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，并通過標準熒光團對于免疫熒光的明智的選擇㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，所以能夠可逆地關閉的熒光團通過激勵它們與一個極端的光強度♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。 當足夠的分子處于OFF狀態時✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，它能夠檢測單個分子的樣品中⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。
分子狀態之間的轉換
圖2：寬視場與GSDIM㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。 PTK2細胞⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。 NPC染色：抗NUP153 / AlexaFluor 532微管染色：抗β微管蛋白/ AlexaFluor 647禮貌：沃納富凱①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，徠卡與安娜絲卡和Jan Ellenberg⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，EMBLⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，德國海德堡協作
一旦熒光樣品通過（激光）光激發☈⊙☉℃℉❅，電子被光子一躍成為*激發態❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。上從*態返回到基態時⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，光略低能量（紅移）射出☈⊙☉℃℉❅。 更高的激光功率增大的光子能打到在地面狀態的電子和電子轉移到激發態的數量❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 其結果是✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，在一給定時間的基態和激發態之間的采樣周期更多的電子✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。 發射的光子數增加和更亮的樣品可以看到ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。
激發光（例如✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，從高功率激光源）的進一步增加可以導致調光器樣品㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，由于減少熒光發射❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 在這個過程的開始☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，增加激發光導致許多電子在地面與*激發態之間循環的高ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。 從激發態電子的一定比例進入斷電狀態웃유ღ♋♂。 *可訪問的子狀態從*激發態是三重態⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。 進入三線態需要一個自旋翻轉電子的✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 旋翻轉具有非常低的發生概率☾☽❄☃，因此是一種非常罕見的事件❣❦❧♡۵。 由此關閉狀態實際上是未填充的樣品的低光照射♀☿☼☀☁☂☄。
關狀態有很長的壽命（以μs為s的范圍內）☾☽❄☃，并用熒光團在關機狀態下的電子不能參與樣品的任何更多的熒光發射♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。 隨著時間的推移越來越多的電子*終在關斷狀態ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，雖然熒光團的總數并沒有改變的樣品顯示暗✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 只是“主動”或“訪問”熒光數量已經改變⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。 在關斷狀態“泵送”電子可以被看作是一個可逆開關✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 熒光團被關閉㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，以電子駐留在關斷狀態的時間☾☽❄☃。 當電子返回到基態時⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，所述熒光團被渲染“有效的”⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，并且可以再次發出熒光⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。電子的分子狀態之間的所有轉換是概率管理的進程ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，因此☾☽❄☃，過渡的確切發生無法預測對于給定的電子⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。（奧林巴斯顯微鏡）
本地化高達納米精度
對*分辨率成像的激光功率保持在一個較高的水平☾☽❄☃，直到只有幾個熒光團中的視場發射光子ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。“活性”熒光團可以循環到地面和*激發態之間的數千倍♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，電子返回到關斷狀態之前產生的光子的“突發”웃유ღ♋♂。 光子“突發”被記錄用高敏感的EMCCD相機✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。 此外❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，只有少數電子填充的基態的時間很短♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，導致“基態耗盡與個別分子返回”（GSDIM）的情況☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。 在一般情況下⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，熒光團發射的光子的脈沖串在空間上完全分離㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，這使得在特定區域中的所有光子的單個分子的分配⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 在這種情況下記錄時⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，衍射限制信號的中心是相同的熒光團的位置❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 熒光團的位置⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，可以計算*多納米精度✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。
圖3（右）：寬視場與GSDIM⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。 高爾基體膜蛋白Giantin和高爾基體基質蛋白GM130✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，免疫熒光染色的Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，分別ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 禮貌靖岡田博士❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，細胞生物學系和解剖學ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，醫學研究生院㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，東京大學⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，日本웃유ღ♋♂。
為什么有機熒光更好
一個*分辨率圖像的*終解決取決于）每個熒光基團（定位精度）和本地化的精準二）個人熒光標記的興趣（染色密度的結構）之間的*小距離☈⊙☉℃℉❅。 染色密度可以影響例如通過免疫染色過程中使用更高的抗體濃度☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。 定位精度取決于來自體熒光收集ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，并可以用下式來近似的光子數量：
Δr：顯微鏡/物鏡衍射極限
N：由一單獨的局部熒光團發射的光子數
Δsms：個別熒光的定位精度
因此✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，要實現10nm的定位精度⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，400光子必須從用顯微鏡遞送200nm的衍射極限分辨率的熒光收集ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 發射的光子的數目是在*個實例中與包埋介質組合的熒光團的性質❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。 作為一個經驗法則ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，有機熒光顯示比熒光蛋白更高的亮度和光穩定性☾☽❄☃。 由此通過這些染料遞送光子的數目要高得多和定位精度顯著改善♀☿☼☀☁☂☄。 *后ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，一個較好的*分辨率圖像可以與“更強”染料狀有機熒光團由于改進定位精度得到♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃！