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介紹

反芻動物的forestomach歷來是上皮運輸研究的建設性模型☈⊙☉℃℉❅，該forestomach⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，特別是瓣胃（圣經）㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，它在營養物從攝取的吸收中起重要作用ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，例如水ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，揮發性脂肪酸❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，礦物質㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，電解質 ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ， 氨基酸（AA）的和小肽⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。有趣的是✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，相比于瘤胃㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，瓣胃具有更強的吸收能力小肽⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。

肽在動物營養的吸收和利用進行了詳細審查別處✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。肽包含在forestomach的可溶性非氨氮一個顯著部分和總氨基酸在反芻動物的門戶排水內臟♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。此外✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，肽可通過乳腺對乳蛋白的合成被利用和由許多其他組織中的營養和功能活性 ☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。一些研究已經表明㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，AA的肽的形式的傳輸比AA中的每單位時間的游離形式更有效ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。此外ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，據報道❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，一個大數量的二和三肽和各種模擬肽的藥物是通過寡肽轉運蛋白1（PEPT1ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，SLC15家族）中腸細胞的頂膜吸收進入胃腸道的上皮細胞⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。

然而ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，在小肽在反芻動物胃腸道中的吸收許多以前的研究已經在動物㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，組織模型或在細胞系中進行的①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。然而❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，大多數這些細胞系已經失去了器官特異性功能ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，由于其分化狀態⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。此外♀☿☼☀☁☂☄，這些研究大多是短期的✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。因此⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，建立基層上皮細胞反芻動物的forestomach孤立的一個長期的文化可能為它們的功能研究的一個更好的模型☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。來自各種動物的瘤胃得到上皮細胞的原代培養之前已經描述⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，如綿羊ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ、小母牛和母羊웃유ღ♋♂，雖然還沒有研究報告長期培養和從奶牛和在這些細胞中的肽吸收的作用得到瓣胃上皮細胞（嗅鞘細胞）的表征ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。瓣胃⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，這是復層鱗狀組織ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，由四個上皮階層⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，如瘤胃：角質層ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，顆粒層ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，棘層和基底層 ⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 然而㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，這是難以分離這些上皮細胞♀☿☼☀☁☂☄。本研究成功地使用特定的胰蛋白酶的濃度和消化時間通過串行消化法分離這些細胞☾☽❄☃。本研究的目的是：（1）建立和表征牛OEC文化和（2）由forestomach上皮細胞在體外用嗅鞘細胞的牛☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，研究小肽吸收的功能㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。

材料和方法

操守準則

這項研究是根據對實驗動物福利（科技部中國科技☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，2006年）的國家指導方針和批準的機構動物護理和使用委員會在浙江大學進行⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。在瓣胃組織是從阜陽屠宰場⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，杭州❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，中國獲得和我們獲準使用這些動物部分從這個屠宰場①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。

細胞培養和存儲介質

在細胞生長培養基由Dulbecco改進的Eagle培養基（DMEM㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，Gibco公司ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，美國）✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，補充有10％（V / V）胎牛血清（FBS）（Gibco公司⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，美國）⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，5μg/ ml的胰島素웃유ღ♋♂，10高葡萄糖制劑納克/毫升的表皮生長因子（EGF①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，Sigma公司♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，美國）⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，100 U / ml青霉素⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，100微克/毫升鏈霉素⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，50微克/毫升慶大霉素和2.5微克/毫升兩性霉素B的新鮮制備的細胞存儲培養基由70％（體積/體積）的DMEM♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，20％（體積/體積）FBS和10％（體積/體積）二甲基亞砜（Sigma公司⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，美國）⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。

分離培養嗅鞘細胞和

牛瓣胃組織被新生中國荷斯坦犢牛獲得它們被宰殺后ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，立即㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，然后運到在冰冷的DMEM實驗室✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。串行胰蛋白酶消化進行㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，以嗅鞘細胞分離如前所述✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。簡而言之ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，將組織洗滌數次✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，用冰冷的D-Hank氏（平衡鹽溶液）含有500單位/毫升青霉素❣❦❧♡۵，500微克/毫升鏈霉素㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，100微克/毫升慶大霉素和5微克/毫升兩性霉素B웃유ღ♋♂，直到溶液是干凈任何污染物☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。接下來ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，瓣胃上皮薄層是用手術刀為約1厘米2片切碎①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。碎薄片（約20g⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，濕重）消化在一個250ml的錐形含有100ml 2.5％胰蛋白酶（Amresco公司ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，美國）在D-Hank氏在搖動溫熱空氣1小時ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，溶液在37℃下的燒瓶浴✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。接著①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，將消化溶液棄去⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，用新鮮溶液替換2或3次웃유ღ♋♂，以除去角質層上皮細胞⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。當一團細胞具有均一的形態出現♀☿☼☀☁☂☄，角化細胞是不占優勢⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，在消化溶液收獲并用新鮮的溶液中①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，約每20至30分鐘웃유ღ♋♂，這取決于消化狀態所取代㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。胰蛋白酶是細胞收獲后終止✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，加入冰冷的D-Hank氏含有10％FBS到消化溶液（以1:1的比例❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，體積/體積）☈⊙☉℃℉❅。過濾與4層的1毫米的尼龍網孔后⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，將收獲的溶液離心分離❣❦❧♡۵，在300×g離心 5分鐘❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，在4℃下☈⊙☉℃℉❅，以從顆粒除去任何殘留的胰蛋白酶⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。接著♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，將組織進一步消化7-8個周期웃유ღ♋♂。使用血細胞計數器對細胞產量進行了評估和細胞存活率分別使用臺盼藍染色ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，估計ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。 將細胞再懸浮于生長培養基中①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，然后接種5×104個細胞/ ml在塑料培養皿（康寧❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，美國）涂布有I型膠原（Gibco）中的密度✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。培養皿在37℃和5％CO2的加濕氣氛和生長培養基根據生長條件改為每2或3天㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。

以純化的上皮細胞✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，融合細胞分別為第一消化用10分鐘☾☽❄☃，0.15％的胰蛋白酶溶液⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。當分離的成纖維細胞⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，并沒有變化⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，嗅鞘細胞進行觀察⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，將細胞用D-Hank氏洗滌✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。接著ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，將剩余的細胞用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化5-10分鐘ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，并接種到新的培養皿中（1:2）✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。對冷凍保存✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，將細胞以1×106個細胞/ ml時ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，分配到冷凍管的密度重新懸浮在存儲介質中♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，并儲存在液氮中㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。

用于蘇木精和伊紅染色⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，將組織固定在4％甲醛溶液中ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。24小時后㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，將組織包埋在石蠟中ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，切成5μm的切片并用H＆E對用標準方法組織學檢查❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。

嗅鞘細胞的生長特性

嗅鞘細胞的體外生長方式是由細胞的倍增時間確定ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。采用WST-8（博士德ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，中國）檢測細胞增殖情況⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。簡言之웃유ღ♋♂，嗅鞘細胞在96孔板（康寧⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，美國）一式四份接種5×103每孔的細胞㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。在特定時間點⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，將10μl的WST-8溶液加入到每個孔中✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。接著ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，將細胞溫育于37℃下反應1小時웃유ღ♋♂，將吸光度在450nm的波長用酶標儀（Molecular Devices公司✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，美國）測定❣❦❧♡۵。活細胞的數目是成比例的吸光度⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。用相襯顯微鏡（Nikon ECLIPSE 50i的ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，東京ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，日本）⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，將細胞的生長和形態進行了評估⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。

電子顯微鏡對嗅鞘細胞的超微結構

嗅鞘細胞用PBS洗滌兩次⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，然后固定☾☽❄☃，用2.5％戊二醛在4℃下過夜⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。將細胞用PBS漂洗兩次①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，后綴♀☿☼☀☁☂☄，用1％************為2小時✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。在串行乙醇稀釋脫水的細胞后♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，將細胞從它們的塑料支撐報廢和嵌入的Spurr樹脂ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。超薄切片中依次沾上醋酸雙氧鈾和堿性檸檬酸鉛☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，每次15分鐘✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，并用透射電子顯微鏡（TEM❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，JEM-1230㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，JEOL）觀察☈⊙☉℃℉❅。

首先對掃描電子顯微鏡（SEM）制成OEC蓋玻片⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。根據標準程序用于TEM固定和脫水后✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，將試樣涂覆有金 - 鈀和使用SEM（飛利浦⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，XL30❣❦❧♡۵，荷蘭）的觀察❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。

免疫細胞化學染色

細胞角蛋白染色⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，將細胞接種于激光共聚焦培養皿（巢㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，中國）♀☿☼☀☁☂☄，并洗滌3次❣❦❧♡۵，用D-Hank氏✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，用于在-20℃下10分鐘ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，用甲醇固定和丙酮（體積/體積）ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，并透化㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，用0.25 ％PBS-的Triton 10分鐘ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。然后將細胞在PBS中含5％正常山羊血清阻斷非特異性蛋白質 - 蛋白質相互作用進行孵育初級兔抗細胞角蛋白18抗體（稀釋至1:50✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，Abcam公司❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，HK）和兔抗PEPT1抗體（稀釋1:100ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，北京博奧森生物技術有限公司☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，中國）一夜之間在4°C✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。隨后ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，將細胞溫育在次級FITC-偶聯的山羊抗兔IgG抗體（稀釋度1:100①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，杰克遜免疫研究實驗室公司☾☽❄☃，美國）⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，用DAPI（Sigma公司ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，美國）웃유ღ♋♂。將細胞在室溫下在黑暗中溫育1小時㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，隨后漂洗3次㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，用PBS進行5分鐘⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，并用激光共聚焦顯微鏡（Leica公司✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，TCS SP5⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，德國）顯影♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。

PEPT1 mRNA的嗅鞘細胞的測定

從牛瓣胃組織總RNA和嗅鞘細胞用冰冷的TRIzol（Invitrogen公司㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，美國）隔離㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。RNA的完整性和純度通過使用NanoDrop 2000分光光度計（熱⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，USA）評估樣品用1％瓊脂糖凝膠電泳☾☽❄☃，并根據在λ260和λ280（> 1.8）的外徑比被確認웃유ღ♋♂。合成采用逆轉錄試劑盒（Takara✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，日本滋賀縣）第一鏈cDNA⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。（;產品長度正向：5'-TGGCTGGGGAAGTTCAAGAC-3'5'-TCCTGGCCCTCTTCAAA-3⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，反向'：239堿基對）用反轉錄PCR使用以下特異性引物檢測PEPT1（NM_001099378）的表達♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，以及甘油醛-6 -磷酸脫氫酶基因（GAPDH✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，AJ000039）擔任內部控制（引物：正向5'-TTGTGATGGGCGTGAACC-3'⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，反向5'-CCCTCCACGATGCCAAA-3';產品長度：198個基點）⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。所用的PCR條件進行以下操作：在95℃下進行40個循環的5秒ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，34號☾☽❄☃，60℃和60秒⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，72℃下用30秒㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，在95℃初始變性和5分鐘的最后延伸72°C㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。擴增的PCR產物用2％瓊脂糖凝膠ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，并用市售的測序公司（BGI⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，中國）測序♀☿☼☀☁☂☄。的DNA序列進行比對來自國家生物技術信息中心數據庫中的已知PETP1序列✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。

攝取甘氨酸-SAR成嗅鞘細胞

glycylsarcosine的攝取（GLY-SAR⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，模型二肽）的嗅鞘細胞是如前所述研究 ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。Hank氏平衡鹽溶液（HBSS：145 mM氯化鈉ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，3 mM的氯化鉀ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，1mM的氯化鈣 ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，0.5毫摩爾MgCl2）含有5mM D-葡萄糖和5mM HEPES（pH6.5）中被用作吸收和沖洗介質ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。嗅鞘細胞鋪板在1×105個細胞/ cm2在24孔板中的密度⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。匯合（約3天）后ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，將細胞保持7天☾☽❄☃，以分化☾☽❄☃。接著ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，用電子顯微鏡✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，這表明細胞已分化形成的微絨毛♀☿☼☀☁☂☄，橋粒和緊密連接下觀察細胞☈⊙☉℃℉❅。在同一天♀☿☼☀☁☂☄，OEC單層細胞漂洗兩次ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，預培養用HBSS 30分鐘㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，在37℃下攝取加入1 ml的培養液在不同pH下（5.0✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，5.5⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，6.5⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，7.5）㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，并為特定時間段（2☾☽❄☃，5✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，10☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，15❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，30分鐘）啟動⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。研究了濃度的甘氨酸基-Sar攝取依賴⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，細胞與不同甘氨酸-SAR的濃度（0.5①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，1.0❣❦❧♡۵，1.5⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，2.5㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，5.0毫摩爾）⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，在37℃或4℃㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。用于抑制研究中⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，將細胞在37℃孵育不同的蛋氨酸 - 甘氨酸（甲硫氨酸 - 甘氨酸）的濃度（0⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，0.5ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，2.5ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，5.0毫摩爾）在一式四份所有孵育均在37℃進行15分鐘✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，在用2.5mM的甘氨酸基-Sar pH為6.5☈⊙☉℃℉❅，除非另有說明⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。在孵育結束時⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，甘氨酸基-Sar溶液吸出㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，并將細胞快速洗滌四次♀☿☼☀☁☂☄，用冰冷的漂洗培養基（pH6.5）中✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。

以確定甘氨酸基-Sar的攝取量⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，裂解細胞用0.3毫升1％的Triton X-100溶液✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。細胞裂解產物中的一部分離心12000×g的10分鐘⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，并使用利用高效液相色譜法（HPLC☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，安捷倫㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，1100⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，美國）❣❦❧♡۵，如下所述進行量化甘氨酸基-Sar㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。裂解液的另一部分被用于使用BCA蛋白測定試劑盒（凱基生物科技❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，南京⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，中國）蛋白質測定ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。GLY-SAR的攝取換算為nmol /毫克protein/15分鐘ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。

HPLC條件：流動相：緩沖液A（0.1％三氟乙酸的水）和B（0.1％三氟乙酸的乙腈溶液）的混合物㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。梯度洗脫ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，運行在10分鐘內✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，從10％緩沖液B為原料✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，以50％緩沖液B☾☽❄☃，以1.0毫升/分鐘的流速㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。采用Kromasil 100-5C 18（4.6毫米×250毫米;阿克蘇諾貝爾公司ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，瑞典）用作分析柱✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。將樣品的等分試樣（10微升）注入HPLC系統和甘氨酸基-Sar是在220nm處進行檢測㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。

統計分析

經方差分析和鄧肯的使用SAS軟件（SAS研究所ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，2000年）復極差測驗進行統計分析ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。該數據被表示為平均值±標準誤差✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。的標準意義成立為P <0.05❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。

結果

嗅鞘細胞的建立及生長特性

消化✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，用2.5％胰蛋白酶為1〜1.5小時后❣❦❧♡۵，角質層除去❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。約5小時后☈⊙☉℃℉❅，大部分的上皮細胞被成功地從組織中分離出不含細胞的子層的污染（ 圖1 ）⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。使用染料排除可行性的研究表明⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，90％的分離的細胞是存活的（ 圖2-A ）⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。分離的細胞粘附于塑料基體的壁培養（12小時后❣❦❧♡۵， 圖2-B ）☾☽❄☃。 隨后❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，嗅鞘細胞開始增殖并經過2〜7天在培養物（圖2-C形成簇之前到達匯合）（ 圖2-D ）☾☽❄☃。成纖維細胞混合嗅鞘細胞的原代培養웃유ღ♋♂。消化用0.15％胰蛋白酶后ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，首先從燒瓶壁ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，其余的嗅鞘細胞分離的成纖維細胞用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，然后被釋放⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。純化后❣❦❧♡۵，嗅鞘細胞顯示均相“鵝卵石”上皮細胞樣形態與幾個可見的成纖維細胞⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。此外⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，有2-4個核仁中的每個OEC和純化的細胞顯示出與在該塑料基體緊密連接的模式（一個清晰的邊界圖2-E ）♀☿☼☀☁☂☄。冷凍和解凍后ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，90％的嗅鞘細胞是存活的✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，并表現出正常上皮形態웃유ღ♋♂。細胞單層形成后數天☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，cuticularized細胞出現上面的嗅鞘細胞（ 圖3-A⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，B ）和單層證明圓頂形結構（ 圖3-C✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，D ）☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。

嗅鞘細胞的生長圖案繪制于圖4中 ㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。的2天的初始延遲后✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，細胞進入對數生長期（2-5天）☈⊙☉℃℉❅，然后將細胞生長緩慢⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，達到平臺期ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。嗅鞘細胞表現出了穩定的成長能力❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，人口倍增62 h的時間（ 圖4）✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。

嗅鞘細胞的超微結構

形成后嗅鞘細胞的單層在7天中文化☈⊙☉℃℉❅，用透射電子顯微鏡和掃描電鏡（觀察嗅鞘細胞單分子膜的超微結構圖5 ）☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。極化單層觀察根尖的微絨毛和對塑料基材一個基底層✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。微絨毛是管腔腸上皮細胞的特征✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。此外♀☿☼☀☁☂☄，橋粒☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，張力原纖維✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，緊密連接和基底膜內陷的融合細胞單層的相鄰小區之間可以觀察到☾☽❄☃。這種類型的OEC單層在下面描述的傳輸研究中使用⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。

細胞骨架18和PEPT1的表達

嗅鞘細胞進行染色以檢查細胞骨架18☈⊙☉℃℉❅，中間絲蛋白和上皮細胞的標記物的表達♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。該細胞表現出很強的免疫陽性染色細胞骨架18（ 圖6 -A）♀☿☼☀☁☂☄。PEPT1抗原表達檢測免疫細胞化學在細胞質和嗅鞘細胞的細胞核（ 圖6 -B）ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。只用第二抗體的陰性對照沒有發現在細胞特異性染色（圖6 -C）㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。

PEPT1 mRNA的表達在兩種上皮組織和上皮細胞（ 圖7 ）㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。擴增的PCR產物的測序顯示100％匹配웃유ღ♋♂，以在GenBank中⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，其還揭示了分離的細胞的上皮起源和建議ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，這些細胞可以用于研究PEPT1的傳輸性質已知的牛線粒體DNA序列✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。

pH值和時間對GLY-SAR吸收由嗅鞘細胞的影響

分離的嗅鞘細胞表現出的甘氨酸基-Sar二肽一個顯著攝取（ 圖8 ）和攝取受細胞外pH值⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。攝取也顯著更高✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，在pH 5.5和6.5相比⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，在pH 5.0和7.5（P <0.05ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ， 圖8-A ）⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，這表明在運輸過程是pH依賴性⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。因此ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，6.5的細胞外pH值被用于后續的實驗웃유ღ♋♂。培養GLY-SAR的攝取的最佳時間也是在嗅鞘細胞（確定圖8-B ）⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。GLY-SAR通過嗅鞘細胞的攝取增加㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，培養時間增加✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，達到了5至15分鐘之間的高原♀☿☼☀☁☂☄。因此ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，在隨后的所有實驗中☾☽❄☃，孵育時間為吸收量為15分鐘⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，以確保轉運飽和☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。

底物濃度☾☽❄☃，溫度和GLY-SAR吸收競爭性抑制劑通過嗅鞘細胞的影響

還審議了嗅鞘細胞在溫度和GLY-SAR濃度的GLY-SAR的吸收的作用ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。GLY-SAR的攝取量顯著高于37℃相比ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，4°C（P <0.05）㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。此外⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，吸收在4℃下呈正比❣❦❧♡۵，甘氨酸-SAR的濃度和線性增加未經高原（ 圖9-A ）ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。溫度對吸收的影響是通過PEPT1而不是被動的路由❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。此外♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，通過PEPT1活性攝取估計在4℃下的總攝取㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，在37℃和被動的攝取之間的差⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。即使在低底物濃度下（<2.5毫米）的介質中ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，吸收在37℃❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，明顯高于比較至4℃❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，表明轉運介導的過程提供更多的吸收的低濃度①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。此外㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，轉運介導的攝取飽和❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，2.5毫米GLY-SAR在介質中☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。當GLY-SAR的濃度大于2.5毫米❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，吸收在37℃相似♀☿☼☀☁☂☄，在4°C✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。此外ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，2.5mM的甘氨酸基-Sar用于隨后的競爭抑制實驗☈⊙☉℃℉❅，其中的Met-甘氨酸抑制甘氨酸基-Sar的攝取（ 圖9-B ）❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。總之❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，這些結果表明☾☽❄☃，同一載體蛋白轉運既GLY-SAR和Met-甘氨酸❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。

討論

嗅鞘細胞的建立與表征

早在新生兒年齡的增長ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，反芻瓣胃的上皮細胞顯示具有完整功能的完整形態結構♀☿☼☀☁☂☄。在這項研究中⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，我們成功開發根據前述方法用于隔離瘤胃上皮細胞的方法웃유ღ♋♂，從初生犢牛隔離嗅鞘細胞⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。形態學檢查和PEPT1 mRNA和未接受抗蠕變飲食初生牛犢的瓣胃上皮蛋白表達證實❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，初生犢牛在結構和功能上配備吸收小肽與成人相似⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。我們也試圖從成年奶牛隔離嗅鞘細胞⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，但遺憾的是都沒有成功⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，因為該細胞高度分化✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，難以純化❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，增殖和傳代培養㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。因為小腿嗅鞘細胞的快速自我更新率❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，細胞有較高的增殖率較成人嗅鞘細胞❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。此外❣❦❧♡۵，它是很容易獲得的新生小牛清潔組織✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，因為它們的胃腸道不沾染飼料和微生物☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。

角質層⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，它主要包括死細胞✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，作為一個屏障⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，以營養吸收 ㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，必須先刪除隔離的謊言下的上皮細胞⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。以前的研究已經表明♀☿☼☀☁☂☄，主瘤胃上皮細胞可從用含有不同濃度的胰蛋白酶的解離解瘤胃中分離❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。在我們的研究中㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，酶消化的五個不同的協議進行了檢查（0.25㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，0.625ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，1.25ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，2.5ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，5％胰蛋白酶）⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，以優化OEC隔離ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。我們發現⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，2.5％胰蛋白酶是最有效的隔離⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，可行性和嗅鞘細胞在體外 （數據未示出）的粘附性✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。它也難以分離ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，由于細胞響應于胰蛋白酶的敏感性的細胞;例如✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，高濃度的胰蛋白酶是有害的細胞和低濃度不能充分有效地分離細胞㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。此外⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，所需要的瓣胃薄層被切成1厘米2枚而不是搗碎☈⊙☉℃℉❅，以避免肌肉或其他細胞的污染從更深的地層相關的上皮⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。我們孤立的嗅鞘細胞的上皮起源的地層使用來自其中的細胞中分離的瓣胃的H＆E染色證實ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。

在這項研究中⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，成纖維細胞和上皮細胞根據它們的不同的敏感性㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，胰蛋白酶進行分離☾☽❄☃，如先前報道⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。以前⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，各種方法被用于抑制成纖維細胞的生長;然而ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，這是不可能用這些方法完全消除這些細胞☈⊙☉℃℉❅。經過一系列的純化步驟中⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，我們能夠消除大部分污染的非上皮細胞（主要是成纖維細胞）的;然而①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，一個小數目的成纖維細胞（細胞培養物不足10％）仍然存在與嗅鞘細胞✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。以前的研究表明⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，非上皮細胞在培養物中的存在可能對上皮細胞的生長和存活的有益效果 ㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。

在這項研究中①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，我們孤立的嗅鞘細胞表現出典型的鵝卵石形態與微絨毛㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，這也觀察了其他隔離牛腸上皮細胞系的頂面和原代細胞✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。此外☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，我們的細胞也確定了瓣胃上皮作為用電子顯微鏡進行評估☾☽❄☃，結果發現細胞間連接（橋粒和緊密連接）和張力原纖維⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，這也被在初級上皮細胞中觀察到從牛瘤胃的存在和結腸上皮✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。此外❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，該細胞具有不斷增殖☈⊙☉℃℉❅，形成融合單層⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，并表達PEPT1和細胞角蛋白18的能力♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，這些特性表明這些細胞的上皮性質❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。此外ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，嗅鞘細胞在塑料基質上的生長表明一個群體倍增62 h的時間和呈現S形生長曲線（ 圖4 ）⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，即正常的非轉化的表型特征☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。因此❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，這是更好接種細胞時⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，融合的單層一直合式后使用這些細胞進行研究ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，5天㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。

在嗅鞘細胞原代培養物♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，cuticularized細胞中出現了單層外面大部分區域♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，這表明我們的分離的嗅鞘細胞進行分化和成熟的體外類似于體內的上皮⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。此外ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，嗅鞘細胞表現出拱頂狀結構在融合后的階段ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，這就出現零星地☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，當細胞在塑料基質上涂有膠原蛋白的生長㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。這種結構已報道發展㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，由于流體的上皮細胞層的下部積累ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。自發穹頂結構的嗅鞘細胞的形成表明⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，這些細胞發生分化和分泌基底膜成分相似的乳腺上皮細胞中報告之前的研究✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。

通過使用OEC模型研究小肽的吸收

PEPT1是一個H+的偶聯肽轉運蛋白❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。我們的研究顯示✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，嗅鞘細胞表達PEPT1的mRNA①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，并采取了GLY-SAR中的pH值依賴性為6.5的最佳pH值♀☿☼☀☁☂☄。這些觀察結果表明♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，PEPT1可能參與在嗅鞘細胞的小肽的吸收ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，而這種吸收是有效的❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，在生理pH值條件下在forestomach①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，這是約pH 6.0的奶牛 ①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。 還已經報道⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，這些肽是由胃腸道通過的活性（轉運介導的）和被動（旁細胞運動和細胞穿透肽）機制分兩路吸收ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。活動路由是由可飽和吸收的肽⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，而被動路由不飽 ㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。 此外❣❦❧♡۵，激活的路由是溫度敏感的✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，而被動路由不是對溫度敏感的⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。在這項研究中ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，甘氨酸基-Sar在細胞中的吸收是受溫度的影響❣❦❧♡۵，并是飽和的基板ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，表明吸收是在肽轉運部分地介導ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。然而ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，我們的數據還表明㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，甘氨酸基-Sar是通過被動路由吸收嗅鞘細胞ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，因為攝取發生在4℃♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，且吸收呈現線性增加✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，對應的增加的濃度ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。我們的動力學測定也表明⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，寡肽轉運蛋白表現出高親和力的底物㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，有效地發揮作用☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，在低濃度⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。

我們的研究還表明ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，該肽轉運系統具有多種底物特異性㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，因為甲硫氨酸 - 甘氨酸能有效地抑制甘氨酸基-Sar攝取ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。滿足-甘氨酸已被證明是PEPT1的襯底在被轉染的哺乳動物細胞系ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，并在中國倉鼠卵巢細胞 ☈⊙☉℃℉❅，這進一步支持PEPT1在這些肽在嗅鞘細胞攝取的潛在參與ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。在低濃度的Met-Gly組成♀☿☼☀☁☂☄，以抑制甘氨酸基-Sar攝取50％需要還表明⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，轉運系統證明甲硫氨酸 - 甘氨酸的高親和性⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。最后♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，這些研究表明❣❦❧♡۵，我們的OEC模式是一個合適的系統來研究肽轉運過程中反芻動物的forestomach❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。

總之①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，我們成功地建立和新生犢牛維持嗅鞘細胞的原代培養⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。培養的細胞保留了上皮細胞的形態學和免疫學特性①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。此外ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，嗅鞘細胞也可能占用小肽在體外和攝取依賴于底物濃度웃유ღ♋♂，溫度ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，蛋白質❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，并且可以使用競爭者所抑制✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。我們還觀察到ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，PEPT1可以負責小肽在嗅鞘細胞的吸收㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。嗅鞘細胞可以被用作各種營養素⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，包括小分子肽在牛forestomach的吸收機制的體外研究中的一種重要模式⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。