徠卡顯微鏡了解腎臟疾病和體內再生的動態過程
腎小球濾過屏障（GFB）是在腎臟glomerulis一個復雜的空間結構❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，其中*濾發生♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。 足細胞是GFB的關鍵因素①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，并參加在過濾過程웃유ღ♋♂。 它們已顯示出參與了腎臟疾病的發展ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 然而❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，由于技術限制웃유ღ♋♂，腎小球病變的機理還不是很清楚⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。 亞諾什PETI-Peterdi的研究小組在美國南加州大學開發出一種稱為串行多光子顯微鏡（MPM）的新方法♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，它允許跟蹤單個腎小球的命運在幾天❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。 *近⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，它被公布為在自然醫學的封面故事 ⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 在這次采訪中㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，他對串行MPM如何影響他的研究意見⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。
你的論文做了它對自然醫學的扉頁❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。 所顯示的圖片㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，以及為什么它被選作封面ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ？ 是什么使得它特別的/有趣嗎ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ？
在封面頁顯示了生活小鼠腎臟的表面區域的視覺吸引力的⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，有代表性的多色彩圖像⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。 圖像被收購通過使用新生成的轉基因小鼠☈⊙☉℃℉❅，我們命名為podocin蛋白-五彩紙屑小鼠體內多光子熒光成像❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 鼠標行單側輸尿管梗阻是腎臟纖維化的經典⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，常用的模型☈⊙☉℃℉❅。足細胞웃유ღ♋♂，一個在腎臟中*重要的細胞類型⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，其中的形式和維持腎小球過濾器①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，被標記的四種顏色之一㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，基于基因編碼的膜定位的CFP（藍色）的細胞特異性表達☾☽❄☃，核GFP（綠色） ⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，胞漿YFP（黃色）或胞質RFP（紅色）☈⊙☉℃℉❅。 標記的葡聚糖（等離子染料）照亮了腎血管⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。 這項新技術有助于識別和跟蹤相同的單足*過病程完整的活體腎移植的命運✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 這對于識別和跟蹤單足細胞未受影響腎臟的改進方法可以提高我們的腎小球損傷和再生的機制的理解⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。 我們相信ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，這種方法的新穎性和重要性幫助這個形象㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，我們的報告使它的封面✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。
時間可能也有幫助☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。 這是該雜志十二月號⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，因此節日⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。 在血管樹的結尾多色標記腎小球看起來像圣誕樹上的圣誕球㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。
請描述串行的MPM❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，你已經開發方面的研究完好腎組織的方法ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。 它是如何工作的⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯？
為了更好地理解足細胞遷移的動態⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，我們在完整的小鼠腎臟在體內發展同腎小球串行MPM成像隨著時間的推移ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，一旦每24小時웃유ღ♋♂。 串行MPM需要多個尚存ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，同樣的動物的微創手術⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 在麻醉小鼠左腎輕輕地從背側切口被很好的耐受性通過動物相比傳統的腹側方法形象化和小鼠放置于加熱的顯微鏡載物臺⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，使用倒置顯微鏡MPM成像☾☽❄☃。 腎臟適于成像的區域被確定與腎臟的位置是注意到相同的位置上隨后的日子里☾☽❄☃。
獲得的Z-堆棧的腎小球后小遙遠區域中的視場的特點是很快把激光束聚焦在具有高功率這個區域⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 這個動作產生一個容易找到的高熒光點（參考點）⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，它在那里停留3-5天♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。 相對于感興趣的腎小球標記的位置被記錄在案☈⊙☉℃℉❅。 成像后㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，腎被放回腹膜后和側面切口關閉與縫合✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。 這個過程重復在同一動物/腎小球24❣❦❧♡۵，48♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，72ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，等等小時后除去縫合線⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，并再次外縫合腎臟✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。 使用這種技術㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，我們能夠隨后找到被標記在所述*成像會話的腎小球約70％✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。 收購具有相同的成像設置為前一天的Z-堆棧標記腎小球ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。
使用Leica TCS SP5的多光子共聚焦熒光成像系統❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，在860納米（相干）和徠卡DMI6000乙倒置顯微鏡的外部nondescanned由一個變色龍*二MP激光器63X徠卡甘油浸入式物鏡（NA 1.3）購入的圖像探測器♀☿☼☀☁☂☄。 短通濾波器（680納米的藍色和紅色♀☿☼☀☁☂☄，700 nm的綠色和黃色）⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，分色鏡（切斷在515 nm的綠色和黃色❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，560納米的藍色和紅色）和帶通濾波器是具體的檢測CFP / GFP / YFP / RFP發射（473納米/ 514納米/ 545納米/ 585納米）（色度）ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。
圖1：單足細胞未受影響腎臟podocin蛋白✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，五彩紙屑用鼠標在體內多光子熒光成像的識別和跟蹤㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。 腎小球毛細血管袢外足細胞被標記的四種顏色之一♀☿☼☀☁☂☄，或者通過膜定位的CFP（藍色）⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，核GFP（綠色）⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，胞漿YFP（黃色）或細胞內的RFP（紅色）ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。 標記的葡聚糖（等離子染料♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，灰度）照亮了腎血管♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。
有什么困難呢㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦？ 什么是新約的串行MPM㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉？
腎小球濾過屏障（GFB）具有由幾種不同的細胞類型ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，包括特殊的間質細胞稱為腎小球系膜細胞✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，內皮細胞⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，足細胞❣❦❧♡۵，并形成了一個非常復雜和動態的三維結構☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。 足細胞是GFB㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，在腎小球毛細血管一個復雜的血管部♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，其血漿*濾的關鍵要素⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。 足細胞是高度分化形成圍繞毛細血管袢的外面長的初級和次級的擴展☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，包裹細胞☾☽❄☃。 它們的相互交叉的足突之間的狹縫狀光闌形成這是GFB的一個關鍵組成部分⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。 *近的基因和細胞生物學的研究強調了在腎小球疾病的發展足的極端重要性❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。 不過❣❦❧♡۵，在了解腎小球病理的機械細節的一個關鍵障礙一直是技術上的限制웃유ღ♋♂，研究GFB在其原生環境☈⊙☉℃℉❅。 由于體內缺乏數據☈⊙☉℃℉❅，仍有顯著差距㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，我們的足細胞動力學和運動及其鏈接蛋白尿和腎小球硬化的理解웃유ღ♋♂。 然而✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，這種洞察力☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，將需要新的治療策略的發展ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。
高分辨率成像工具的應用ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，尤其是該系列的MPM方法可以提供長期失蹤的體內技術足細胞研究⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 MPM是一種***的✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，微創光學切片技術ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，它允許在小鼠腎臟包括體內腎小球的成像☈⊙☉℃℉❅。 串行MPM代表了一種新的技術進步這使我們㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，對于*次㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，腎小球疾病的過程中⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，以可視化的完全相同的足細胞/腎小球區域（組織體積）在幾天的完整活腎ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 沒有任何其他現有的技術能夠實現這一目標⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。 優點包括（i）克服腎小球異質的問題ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，（ii）建立的動力學和細胞遷移⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，組織重塑和（iii）與功能性的測量相結合的圖案✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。
你是通過串行MPM取得哪些新的見解㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，你是不是能夠得到這樣呢☾☽❄☃？
串行MPM成像是有助的在描繪☾☽❄☃，*次❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，動力學和腎小球形態學ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，細胞成分⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，并常在24小時之前的成像會議內發生足細胞突起的巨大變化ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。 我們發現的證據⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，足細胞遠離自己平時解剖位置的遷移⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，從腎小球一簇☈⊙☉℃℉❅。 我們的數據支持高動態（新范式）ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，而不是靜態的性質腎小球環境和細胞組成（目前教條）웃유ღ♋♂。 此外⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，一個新的解剖學發現是連接內臟（足細胞）和頂葉皮層（胸肌）可能參與細胞 - 細胞通訊和細胞遷移的納米管的*可視化웃유ღ♋♂。
是如何串行MPM改變你的研究㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉？
新型小鼠模型用熒光細胞譜系標記序列的MPM是一種新型的✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，*設備♀☿☼☀☁☂☄，**的**的✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，成像的方法⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，我們將繼續利用我們的研究㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，直接和定量可視化在不同腎細胞類型的招聘和命運體內和解決它們的功能和作用在腎血管和腎小球重塑在健康和疾病ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。 到目前為止웃유ღ♋♂，我們已經開發了幾種新的轉基因小鼠模型中㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，七種不同腎細胞類型可以由基因編碼的☈⊙☉℃℉❅，多色熒光蛋白的表達特異性標記♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。
與串行ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，活體成像的MPM技術突破相結合這一新的工具箱是一個巨大的技術進步為我們的研究計劃웃유ღ♋♂，并允許我們⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，并會繼續讓我們來研究正常和病變的腎臟功能的動態的活體腎在*的細節☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。 這種新技術的應用使我們能夠產生幾個高度創新的理念和方法♀☿☼☀☁☂☄，包括新的☈⊙☉℃℉❅，非傳統的機制和作用于許多不同腎細胞類型的鑒定和表征☈⊙☉℃℉❅。
在干/祖細胞研究的新進展帶來了新的視角和專注于組織再生和生物醫學科學的多個領域㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，包括腎臟和心血管（病理）生理細胞命運的改變⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 新穎的技術已經成為可用的細胞系和不同器官單個細胞的命運跟蹤的熒光標記⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。 我們將利用這些***的研究工具웃유ღ♋♂，結合串行MPM來推進我們的功能和腎功能的特定細胞類型（如致密斑的足細胞웃유ღ♋♂，細胞✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，腎素分泌細胞☈⊙☉℃℉❅，腎小管上皮細胞⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，毛細血管和淋巴管內皮細胞的命運的理解☾☽❄☃，間充質祖細胞✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，等等）⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，它是腎和腎小球功能（如腎小球濾過㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，腎血流量⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，腎小管分泌和再吸收）ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，腎素 - 血管緊張素系統的關鍵部件⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，并且還重要的參與者腎臟病理學的重要調節劑❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
什么是方法的未來的可能性❣❦❧♡۵？
除了跟蹤細胞遷移和命運變化✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，腎臟疾病中組織重塑的時間動態的ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，我們可以使用串行MPM成像疾病的過程中了解的變化ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，細胞內和細胞 - 細胞信號傳導ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 例如웃유ღ♋♂，小鼠足細胞中的基因編碼的鈣指示劑GCaMP3的細胞特異性表達系列MPM成像是*近成立在我們的實驗室㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。 這種新方法使我們能夠腎小球硬化和腎纖維化的發展過程中定量可視化鈣升高的足細胞㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，并在腎小球濾過㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，血管通透性⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，與足細胞損傷和病理的傳播病理改變他們的致病作用웃유ღ♋♂。
說明體內這種技術進步웃유ღ♋♂，足細胞鈣成像的文件目前正在印刷中的臨床研究雜志ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 與腎臟結構和功能的串行MPM成像相結合☈⊙☉℃℉❅，新穎的酶Cre /液氧為基礎的轉基因方法將幫助我們在今后的工作中特別標注⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，操作（消融）細胞在體內的腎臟完好ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，敲出特定基因特別是在某些細胞類型（條件性敲除小鼠）☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，并分析其在健康和疾病的腎功能和腎血管和腎小球重塑的作用⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。 使用未來的⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，不斷發展的成像技術和預期進一步推活體的限制ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，許多腎細胞類型⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，包括足細胞的功能性成像方法（如長波長的紅外激光⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，極敏感探測器♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，*分辨率納米顯微）ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。