尼康顯微鏡的激光共聚焦顯微鏡原理
2020-09-04 09:50:49
激光共聚焦掃描顯微技術（Confocal laser scanning microscopy）是一種高分辨率的顯微成像技術☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。普通的熒光光學顯微鏡在對較厚的標本（例如細胞）進行觀察時ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，來自觀察點鄰近區域的熒光會對結構的分辨率形成較大的干擾①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。共聚焦顯微技術的關鍵點在于❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，每次只對空間上的一個點（焦點）進行成像⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，再通過計算機控制的一點一點的掃描形成標本的二維或者三維圖象㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。在此過程中♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，來自焦點以外的光信號不會對圖像形成干擾✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細節分辨能力⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。
圖1. 共聚焦顯微鏡簡化原理圖
圖1是一般共聚焦顯微鏡的工作原理示意圖✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。用于激發熒光的激光束(Laser)透過入射小孔(light source pinhole)被二向色鏡(Dichroic mirror)反射❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，通過顯微物鏡(Objective lens)匯聚后入射于待觀察的標本(specimen)內部焦點(focal point)處㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。激光照射所產生的熒光(fluorescence light)和少量反射激光一起❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，被物鏡重新收集后送往二向色鏡①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，直接通過二向色鏡并透過出射小孔(Detection pinhole)到達光電探測器(Detector)（通常是光電倍增管（PMT）或是雪崩光電二極管（APD））ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，變成電信號后送入計算機⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。而由于二向色鏡的分光作用✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，殘余的激光則被二向色鏡反射㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，不會被探測到⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。
圖2. 探測針孔的作用示意圖
圖2解釋了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的點所發出的光才能透過出射小孔☾☽❄☃；焦平面以外的點所發出的光線在出射小孔平面是離焦的♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，絕大部分無法通過中心的小孔㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。因此⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，焦平面上的觀察目標點呈現亮色✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，而非觀察點則作為背景呈現黑色㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，反差增加㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，圖像清晰♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。在成像過程中ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(focal point)是一一對應的關系（共軛conjugate）,因而被稱為共聚焦（con-focal）顯微技術㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。 共聚焦顯微技術是由美國科學家馬文•閔斯基(Marvin Minsky)發明的⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾；他于1957年就為該技術申請了**⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。但是直到八十年代后期㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，由于激光研究的長足進步㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，才使得激光共聚焦掃描顯微技術（CLSM）成為了一種成熟的技術㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。
圖3. 激光共聚焦顯微鏡原理框圖
當今的激光共聚焦顯微鏡已經發展為一種結合了激光技術㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，顯微光學❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，自動控制和圖像處理等多種**科研成果的高技術工具♀☿☼☀☁☂☄。是現代微觀研究領域不可缺少的利器之一☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。Nikon秉承“信賴與創造”的一貫企業理念❣❦❧♡۵，正在為業界提供*水平的共聚焦顯微鏡系統產品ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。
圖4. Nikon新一代A1激光共聚焦顯微鏡系統