徠卡顯微鏡♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，CARS顯微成像特點分子振動對比
相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡是一種技術✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，分子的振動簽名的基礎上生成圖像☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。這種成像方法不要求標注的✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，但重要的生物分子的化合物的范圍內♀☿☼☀☁☂☄，可以得到分子的特定信息☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。本文簡要地強調汽車的功能✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，并討論了一些令人興奮的成像引入這種新的成像方法的可能性❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
探測分子的振動
分子的化學鍵能撼動㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，彎曲和撥浪鼓✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。他們做這些運動特別是利率或頻率✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。這些頻率是如此特別✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，我們可以找出什么樣的化學鍵是劍拔***張到其特定的振動頻率調諧㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。例如❣❦❧♡۵，許多有機分子中含有碳和氫原子之間的債券☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，因此웃유ღ♋♂，他們有CH振動♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。更重要的是⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，C-H鍵的振動頻率是非常不同于其他化學鍵的振蕩運動①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，如O-H鍵ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，氧 - 氫鍵⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。換言之♀☿☼☀☁☂☄，通過檢查一個分子的振動頻率時웃유ღ♋♂，我們可以說有關化學結構的分子的顯著的東西⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。這樣的振動分析對應的化學分析ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。
這些振動可以得到解決①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，通過檢查與光分子❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。不幸的是⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，分子振動的頻率比可見光波的振蕩頻率要低得多⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。這意味著♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，我們不能直接收聽到這些分子的議案❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，包括常見的光源類型的激光器⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，光學顯微鏡的一部分✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。然而⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，分子可以以間接的方式進行檢查⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。拉曼光譜是這種間接檢查的一個例子❣❦❧♡۵。在拉曼光譜和顯微鏡ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，現有的激光束處理樣品和關閉分子散射的光分析①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。這是一種不同的顏色比激發光的散射光可能包含的分子振動的信息✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。這種方法看起來非常相似⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，熒光測量㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，但收集到的信息是非常不同的㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。在拉曼光譜的激光拉曼散射光之間的頻率差對應的頻率的化學鍵✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。使用適當的過濾器和能譜儀㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，它是可以自信地收集拉曼散射光在光學顯微鏡下⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，從而收集有關樣本的化學信息♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。這提供了**的可能性♀☿☼☀☁☂☄。由于幾乎所有的分子具有特定的化學鍵的振動是拉曼活性⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，這是可能的⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，而不需要任何外在的標簽生成的樣品的化學地圖①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。毫不奇怪⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，這一功能已經引發了許多研究學科☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，包括材料合成㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，法醫研究㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，礦物學☾☽❄☃，毒理學和化學分析藝術品的利益☈⊙☉℃℉❅。
拉曼光譜儀和顯微鏡還可以在生物學產生了影響❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。拉曼顯微鏡使標簽的方式✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，這將打開機會對研究生物樣品㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，難以染色或準備標準的光學檢測的細胞和組織的研究ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。比如⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，拉曼光譜儀已被證明是足夠敏感的健康和癌組織的化學組成的細微的差別⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。拉曼顯微鏡盡管其生物研究的巨大潛力ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，還沒有完全成熟✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，成為一個常規成像技術在生物學實驗室♀☿☼☀☁☂☄。拉曼顯微鏡在組織和細胞研究的影響有限的原因是拉曼信號的固有弱點㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。因為激光拉曼效應探測分子間接：沒有光的分子振動的共振信號弱☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。拉曼效應是可測量的㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，但是웃유ღ♋♂，相對于熒光☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，這是一個非常弱的效果♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。這意味著ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，記錄的拉曼圖像需要更長的時間比服用的熒光圖像ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。在一秒鐘內可以采取ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，而多數的熒光圖像☈⊙☉℃℉❅，拉曼圖像相同的尺寸會需要一個小時或更多⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。顯然ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，這樣的圖像的采集時間是非常有吸引力的生物成像應用❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
CARS顯微鏡使新的見解☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，生物和材料樣品
這是否意味著⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，拉曼顯微鏡有沒有快速生物成像領域的未來✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴？幸運的是✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，有替代拉曼技術❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，顯著提高的信號電平✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。非線性拉曼技術利用*快脈沖激光ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，和更有效的方式探測中的分子的振動響應❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。物理웃유ღ♋♂，非線性拉曼技術使分子振動步調一致ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，產生相干信號ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，*多可以有5個數量級高于常規拉曼光譜ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。有幾個非線性拉曼光譜技術ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，如相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，所有這些探測相同的拉曼活性的分子振動ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。這些技術絕不是新的：在20世紀60年代奠定基礎的非線性拉曼方法❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。在家庭內部的非線性拉曼方法☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，汽車是*種方法㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，已經成長為一個用戶友好的顯微鏡工具ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。*CARS顯微鏡的歷史可以追溯到1982年⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，但*個有用的生物實施表現出了一點⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，在十多年前웃유ღ♋♂，1999年❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。從那時起❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，CARS顯微鏡技術已經成熟到一個易于使用的成像工具ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，強調發布的徠卡TCS CARS顯微鏡☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，它增加了光學顯微鏡的調色板實時振動對比☾☽❄☃。汽車的成像方式㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，提供快速和清脆什么可預期的共聚焦熒光顯微鏡圖像❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。手頭有了這樣的成像能力ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，一個**的成像應用領域指日可待⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。
脂質和蛋白質
CARS顯微鏡的應用范圍是什么☈⊙☉℃℉❅？CARS顯微鏡已經取得了顯著的影響❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，在該地區的脂質成像ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。脂類可以可視化調整到CH 2對稱伸縮振動的脂肪分子✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。對于實施例中♀☿☼☀☁☂☄，CARS顯微鏡可以區分飽和的和不飽和的脂肪⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，它可以選擇性地檢測膽固醇和膽甾醇酯✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，它可以揭示脂膜的填充密度的信息❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。CARS顯微鏡是不夠敏感⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，拿起信號從單一磷脂膜㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，使膜生物物理學的研究中ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，囊泡運輸和細胞器的映射⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。強勁的汽車脂質信號也促使研究脂質代謝✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，細胞內脂質體販運ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，并專注于脂質積累和腫瘤生長之間的相關性的研究❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。*顯著✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，**的CARS信號從富含脂質的髓鞘透露了幾個重要的進展和治療的neurodegenerate疾病的見解ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。
另一個振動響應♀☿☼☀☁☂☄，有利的是蛋白質♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。CARS顯微鏡雖然無法得出結論鑒別蛋白質ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，它是未能生成地圖的蛋白質密度㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。CH 3甲基伸縮振動手柄映射出的蛋白質在組織和細胞中分布提供了方便♀☿☼☀☁☂☄。病變組織蛋白密度的空間分布往往是重要標志☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。
圖1：在M1巨噬細胞脂質積累☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。巨噬細胞中生長在培養基中含有氧化型低密度脂蛋白⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。血脂是通過2845厘米-1 CH 2振動的脂肪血脂是顯性可視化♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。
圖2：腎組織多式聯運非線性顯微鏡ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。雙光子激發自體熒光（綠色）用于突出顯示在腎小管細胞⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，而CARS信號用于指示在組織間質的脂質❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
圖3：CARS圖像的纖維素纖維✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。該纖維是通過纖維素鏈的多聚葡萄糖的C-H振動的可視化☾☽❄☃。
圖4：血脂線蟲分布❣❦❧♡۵。明亮的信號CH 2對稱伸縮振動脂肪脂質✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。
水和藥物的擴散
CARS顯微鏡也被用來監測水動力學✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，生物和合成系統的*方法㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。組織水的O-H伸縮振動提供了一個敏感的探頭⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。這使水的滲透研究☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，以單核細胞和細胞器☾☽❄☃，除了水分動態的設計的微結構材料⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。
CARS顯微鏡無標記性和無創性使得該技術非常適合用于監測在體內通過皮膚局部應用的化學品滲透웃유ღ♋♂。CARS已被用于后續的礦物油中的擴散⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，通過皮膚[ 8 ] 在動物模型中☾☽❄☃，*近也被證明工作在皮膚上的人類患者的方法①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。
聚合物薄膜和納米粒子
除了 標簽自由的化學成像的組織和細胞✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，CARS顯微鏡已經采用聚合物膜的化學組成和制造微結構的可視化⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。對比度可以是來自于聚合物中的碳網的振動㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，或從羰基的有機分子웃유ღ♋♂。CARS信號從許多聚合物結構足夠堅固⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，以用于廣泛的各種的振動拉曼簽名為成像的目的撥號㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。此外ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，CARS顯微鏡可以探測分子系統✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，具有很強的吸收功能㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。碳納米管❣❦❧♡۵，例如☾☽❄☃，可以單獨可視化在CARS顯微鏡ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。同樣地♀☿☼☀☁☂☄，半導體納米粒子✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，如硅和鐵的氧化物納米結構可以可視化的一個由一基于非線性CARS響應ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。重要的是①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，的CARS信號從這些納米粒子的不擔保持續的樣品成像不衰落的對比度的情況下ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，光漂白㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。這些實施例說明成像CARS顯微鏡在材料科學中的應用ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，有一個廣泛的☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。
的非線性拉曼顯微鏡♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，熒光顯微鏡相比①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，是相對比較年輕ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。盡管如此❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，非線性拉曼技術的影響已經可以聽到響亮而明確的ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，特別是在無標記生物組織成像☈⊙☉℃℉❅。而不是與熒光技術的競爭ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，能夠迅速產生振動的對比基礎上的圖像增加了一個新的層面♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，對現有的光學顯微鏡對比機制⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。汽車成像方式的商業化提供給顯微鏡更多選項檢查照明樣品的微觀細節①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。與新的對比來新的發現☈⊙☉℃℉❅。這是令人興奮怎么看CARS顯微鏡等技術웃유ღ♋♂，還可以擴大我們對微觀世界的認識❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。