尼康顯微鏡：CCD成像基本原理
顯微攝影的主要媒介웃유ღ♋♂，在過去的50 年里㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，一直是電影♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，曾在科學界以及無數忠實地再現圖像從光學顯微鏡웃유ღ♋♂。它只有在過去十年中⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，在電子相機和電腦技術的改進已經使數字成像更便宜和更容易使用☾☽❄☃，比傳統攝影✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。
在圖1 所示的是一個尼康 Eclipse 600 傳輸 / 反射光顯微鏡配備售后市場的珀耳帖冷卻的數碼相機能夠在一個較長的累積期間整合圖像ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。的照相機系統的控制由一個單獨的單元♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，其容納在一個 IBM 兼容個人計算機的 FireWire 端口的接口✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。整合期間和其他圖像采集參數選擇由專用的基于 Windows 的軟件程序ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。
當相機具有電荷耦合器件（ CCD ）成像傳感器集成在傳感器上或非常接近的模擬至數字（ A / D ）轉換器❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，它一般被稱為作為數碼相機⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。由于 CCD 芯片⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，像所有的光學傳感器ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，模擬設備產生的電壓不同的流⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，數字一詞僅用于當那些在計算機兼容格式在相機和輸出電壓進行數字化處理☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。在一個 12 位的數碼相機中⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，從 CCD 的模擬信號被數字化❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，由板上的 A / D 轉換器具有 12 位深度웃유ღ♋♂。與否的輸出實際上可以被分解為 4096 個離散的強度水平（ 12 位）取決于相機上的噪聲⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。為了區分個人之間的強度等級⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，每個灰度級的步驟應該是大于約 2.7 倍的相機噪聲㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。否則⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，步驟 2982 和 2983 之間的差異☈⊙☉℃℉❅，例如✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，不能得到解決的任何程度的確定性✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。一些所謂的 12 位相機有這么多的相機噪音不能受到歧視⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯， 4096 個離散的步驟①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。
如果開始的是模擬信號❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，數字化過程中的相機㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，而不是下游某處為什么☈⊙☉℃℉❅？使用相機的A / D 轉換器有兩個好處：減少噪音和計算機兼容直接輸出✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。一般情況下ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，越接近 A / D 轉換是到傳感器時☈⊙☉℃℉❅，噪聲電平越低웃유ღ♋♂。從 CCD 的低層次的模擬信號噪聲比他們高層次的數字更為容易損壞⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。在理想情況下ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，在 A / D 是 CCD 芯片上♀☿☼☀☁☂☄，緊鄰的傳感器的輸出放大器ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。噪聲越低⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，更多的灰度級可以被識別⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，因此ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，可以被有效用于強度測量的位數越多⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。
數碼相機的模擬對應的幾個優點☾☽❄☃。數碼相機產生不同于攝像機的隔行掃描信號生成逐行掃描輸出✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。需要專門的隔行掃描視頻信號的數字化采集板和幀緩沖區✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。逐行掃描攝像機的輸出可以直接連接到計算機（例如❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，IEEE-1394 ♀☿☼☀☁☂☄， RS-422 或 SCSI 接口）⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。在逐行掃描相機⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，整個圖像的曝光時間（也表示為整合期）期間首次收購☈⊙☉℃℉❅，然后讀出⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，線線從頂部底部的圖像웃유ღ♋♂。現代高速放大器和 A / D 轉換器⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，允許數碼相機全幀圖像的速度等于或超過視頻幀速率✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。
數碼相機的另一個優點是❣❦❧♡۵，輸出完全適合在計算機顯示器的格式✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。由于信號已經數字化⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，圖像存儲❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，處理和顯示ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，大大簡化了類似的演習相比✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，使用視頻信號❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。數碼攝影照片⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，幻燈片和底片的處理中被淘汰的困難㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，因為現在許多科學期刊接受的數字圖像文件ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。其結果是提高質量公布的圖像中顯示的演示☾☽❄☃。數字化圖像處理웃유ღ♋♂，壓縮⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，通過網絡傳播⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，粘貼到文檔中✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，或調整成一張海報☈⊙☉℃℉❅。
CCD架構
兩個CCD 數碼相機設計中常用的隔行傳輸和幀傳輸㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。的行間傳輸 CCD 采用電荷轉移通道㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，每個光電二極管的旁邊①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，使得所累積的電荷可以是有效地和快速地交給他們的移位器（圖 2 ）❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。隔行傳輸傳感器也可以被電子關門傾倒所存儲的電荷☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，而不是轉移到傳輸信道由 “ 關 ” ⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。幀轉移 CCD 采用由兩部分組成的傳感器ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，其中的上半部分是由一個不透光的掩膜覆蓋ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，并用作存儲區域⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。光被允許落在露天部分⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，所積累的電荷ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，然后迅速移入標記的存儲區域⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。而信號的受光部的傳感器被集成時㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，所存儲的電荷被讀出①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。
科學應用的波長選擇過濾器或傳感器的攝像頭單CCD 攝像頭❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，用于兩種類型的數碼相機的色彩✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。兩者都使用過濾器來產生紅色⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，綠色和藍色的版本的字段的視圖ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。單傳感器攝像機使用一個濾光輪或液晶可調諧濾波器웃유ღ♋♂，獲得紅色✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，綠色和藍色的圖像順序的⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。三個傳感器的相機有一個分光棱鏡和修剪過濾器ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，使每個傳感器圖像適當的顏色⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，并同時獲得所有三個圖像❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。不變的是☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，彩色攝像機的比單色因為加分束和波長選擇元件較不敏感ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。在某些應用中❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，特別是免疫能力或快速連續同時捕捉多個波長的靈敏度的損失所抵消⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。此外♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，一些彩色攝像機達到一個更高的分辨率♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，通過對角抵消了紅色⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，綠色和藍色的傳感器①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，每個傳感器的像素的三分之一⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，從而增加兩倍獲得的樣本的數目⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾。
雖然CCD 攝像機的制造商和用戶經常是指每個光電二極管的像素（圖像元素）㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，就沒有必要的傳感器和在計算機監視器或打印機中的像素的數量和位置之間的對應關系♀☿☼☀☁☂☄。然而⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，顯示器或打印機的分辨率應至少高達傳感器❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
量子效率（QE ）是指✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，被檢測到的入射光子數的百分比✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。（為便于參考㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，我們的明視覺的 QE 是 3 ％左右 ; 圖 3 ）♀☿☼☀☁☂☄。硅光電二極管①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯， CCD 的基本構造塊的ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，具有較高的量子效率（ 80 ％）在廣泛的范圍的可見光譜和近紅外到⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，如在圖 3 中示出⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。的 CCD 的分光靈敏度低于一個簡單的硅光電二極管✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，因為 CCD 電荷轉移通道在其表面上✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，可以降低峰值量子效率為約 40 ％♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃。
最近ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，一些科學級CCD 的渠道的透明度已增加☈⊙☉℃℉❅，量化寬松政策在藍綠色的范圍提高到近 70 ％⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。從表面通道的損失完全消除在背照式 CCD ⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。在本設計中ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，光落到后面的 CCD 的區域中❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，已經通過蝕刻減薄ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，直到它是透明的⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。可實現高達 90 ％的量子效率☾☽❄☃。然而⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，早變薄的結果是♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，至今為止⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，只采用科學級✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，慢掃描 CCD 相機在一個微妙的㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，相對昂貴的傳感器⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。
在CCD 相機的噪聲
有兩個主要的噪聲源在CCD 相機的暗噪聲和讀出噪聲⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。雖然已取得了很大的改進在過去的幾年里⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，在室溫下在減少 CCD 暗噪聲ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，冷卻芯片進一步降低了噪音每 20℃ 下降了十倍☾☽❄☃。黑暗的噪音是最明顯的ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，因為 “ 熱 ” 在積分周期為 4 或 5 秒后①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，與室溫 CCD 相機獲得的圖像的像素（白點）⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。冷卻至 0℃ ❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，通常是足夠的積分周期長達 30 秒⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。需要很長的風險（例如ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，化學發光法）的實驗需要傳感器的溫度更低ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。數碼相機提供在非制冷或制冷版本ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。
噪聲源不同❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，數碼相機웃유ღ♋♂，以及幾種常見的類型為示波器圖4 中的痕跡ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。光子噪聲❣❦❧♡۵，暗電流①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，固定模式噪聲웃유ღ♋♂，和光響應不均勻性所產生的 CCD 的本身☈⊙☉℃℉❅，而復位噪聲⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺， I / f 噪聲和量化噪聲的數字輸出的模擬信號的放大和轉換過程中發生♀☿☼☀☁☂☄。 CCD 芯片上♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，每個光電二極管所存儲的電荷（即ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，像素）轉換成要量化的 A / D 轉換的模擬電壓的放大器中產生的讀出噪聲ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。讀出噪聲可以被看作是 “ 收費 ” ✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，用于讀取所存儲的電荷必須支付⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。如果此收費已穩步下降 5-10 電子 / 像素由于在 CCD 設計的改進❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，在過去的幾年中⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，時鐘和抽樣方法的大小⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。讀出噪聲讀出速度成比例地增加☾☽❄☃。去的成本⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，更快的更多的噪聲✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，因此㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，更多的不確定性中的電壓確定較低分辨率的位數號碼ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。這就是為什么慢掃描攝像機通常具有較低的讀出噪聲比更快的輸出檢測器⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，并具有較高的有用比特數❣❦❧♡۵。數字 came4ras 范圍從 8-12 位深度為 30 幀每秒輸出 16 位深度在 1-2 幀每秒☈⊙☉℃℉❅。
要的速度/ 讀出噪聲問題的解決方案之一是在一個大的 CCD 使用多個輸出放大器（抽頭）✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。而不是讀取所存儲的電荷⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，從整個 CCD 通過一個輸出放大器ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，該傳感器被分為 4 個或 8 個部分☾☽❄☃，每個都具有其自己的放大器⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ。圖像讀出部分♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，然后縫合在一起⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，在軟件中的每秒數幀的速率웃유ღ♋♂。每個放大器所需的速度和相關的噪音也相應降低❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。
信號噪聲比
由于光子隨機到達傳感器表面❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，它們的數量波動與泊松統計檢測到的光子數的平方根等于所描述的噪聲㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。當然✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，相機噪音將這個光子的統計噪聲⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，進一步降低S / N ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。最高的 S / N ①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，可以通過一臺數碼相機的最大累積電荷（全井容量）的平方根✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。一個簡單的估計點的任何圖像的同質區域的 S / N 是該地區的平均強度除以該地區的強度的標準偏差的利息☾☽❄☃。
多少像素的數碼相機已經足夠㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦？
的分辨率的CCD 光電二極管和它們的大小相對于投影的圖像的數量的函數ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。現在已是司空見慣的數碼相機 CCD 1000×1000 的光電二極管陣列ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。消費者和科學級 CCD 制造的趨勢是減少⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，傳感器尺寸為 4 x 4 微米小一些 CCD 光電二極管⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤。從采樣理論ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，只能達到足夠的分辨率的一個對象⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，如果至少有兩個樣本為每一個解析的單元☈⊙☉℃℉❅。（許多用戶喜歡三個樣品每解析單位⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，以確保有足夠的采樣）✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。
最大分辨率像素的大小要求
在光學顯微鏡
|
物鏡
|
分辨率限制
|
投影尺寸CCD
|
所需的像素大小
|
|
4 X （0.20 ）
|
1.5
|
5.8
|
2.9
|
|
10 X （0.45 ）
|
0.64
|
6.4
|
3.2
|
|
20 X （0.75 ）
|
0.39
|
7.7
|
3.9
|
|
40X（ 0.85 ）
|
0.34
|
13.6
|
6.8
|
|
40X（ 1.30 ）
|
0.22
|
8.9
|
4.5
|
|
60X（ 0.95 ）
|
0.31
|
18.3
|
9.2
|
|
60X（ 1.40 ）
|
0.21
|
12.4
|
6.2
|
|
100×（ 0.90 ）
|
0.32
|
32.0
|
16.0
|
|
100×（ 1.25 ）
|
0.23
|
23.0
|
11.5
|
|
100X（ 1.40 ）
|
0.21
|
21.0
|
10.5
|
表1
在落射熒光顯微鏡ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，阿貝1.4 的數值孔徑鏡頭在 550 納米的衍射極限是 0.22 微米㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。 100 倍的物鏡❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，受衍射限制的點上的 CCD 面對投影大小為 22 微米ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ。只是讓一個光電二極管尺寸為 11×11 微米的光學和電子的分辨率要匹配☈⊙☉℃℉❅，一個 7×7 微米光電二極管的首選ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。在光學顯微鏡的最大分辨率像素大小的要求列在表 1 中的 4 倍到 100 倍的物鏡放大倍率范圍ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。 100 倍的 物鏡 并沒有額外的放大倍率7×7 微米的光電二極管✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥， 1000×1000 CCD 捕獲 70×70 微米的物體平面的一個字段的視圖㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。當適當的采樣適當地調整大小的圖像投射到 CCCD ❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，更大數量的 CCD 中的光電二極管✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，而不是增加該字段的視圖的分辨率①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯。各種輸出設備的分辨率的要求☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，可能需要在傳感器的過采樣ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，使最終的產品（例如ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，幻燈片ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，打印或海報）有足夠的分辨率的最終尺寸㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。
intrascene動態范圍表示的強度的有用的范圍內ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，可同時檢測到相同的字段的視圖☾☽❄☃。 interscene 的是動態范圍的強度的范圍內時⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，可以容納不同的視場的檢測器增益❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，積分時間㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，鏡頭的光圈或其他變量作相應調整❣❦❧♡۵。雖然小的 CCD 傳感器上從分辨率的角度來看是可取的⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，它們限制了動態范圍內的設備☈⊙☉℃℉❅。的 CCD 的全阱容量是約 1000 倍✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，每個光電二極管的橫截面面積❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。因此✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥， 7 X7 微米像素的 CCD 全阱容量 49000 電子或空穴✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴。（甲孔的區域的硅從該電子來構成和檢測到的光子的同樣有效的㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，可以使用的措施⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。使用的術語電子⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，雖然大多數的 CCD 讀出產生的空穴而不是電子的數量☈⊙☉℃℉❅。）由于 CCD 的不具有固有的增益⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，一個電子 - 空穴對的每個檢測到的光子的累積♀☿☼☀☁☂☄。
通常被定義為全井容量除以由相機噪聲的CCD 的動態范圍❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。黑暗中☈⊙☉℃℉❅，讀出噪聲的總和的平方和的平方根計算的相機噪聲㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦。因此⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，一個 49000 電子全井產能的 CCD 讀出噪聲和暗噪聲可以忽略不計的 10 個電子的動態范圍大約是 4900 ㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，對應于 12 位⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。但是⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，數字化ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，如果這樣的相機的輸出在 12 位深度意味著⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤， 49000 電子分為 4096 A / D 轉換單元ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，每個包含 12 個電子（四千 ○ 九十六分之四萬九）☈⊙☉℃℉❅。由于噪聲是 10 個電子ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，每個灰度級的步驟僅是 1.2 倍的噪音和不能夠被辨別ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。在 10 位的數字化會導致在每個 A / D 單元 49 的電子☈⊙☉℃℉❅，約 5 倍的噪聲電平☾☽❄☃，并在 1024 個灰度級中的每一個然后可以判別❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣。一個制表位深度的灰度層次和動態范圍（分貝）表 2 所示웃유ღ♋♂，它涵蓋了一系列有五個量級❣❦❧♡۵。
控制速度♀☿☼☀☁☂☄，有效像素尺寸和實地查看
慢掃描的數碼相機允許的控制所讀出的速率❣❦❧♡۵，在像素的有效大小✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，構成一個傳感器和該字段的視圖㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。科學級CCD 相機通常提供兩個或兩個以上的讀出率ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，所以㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，速度可抵銷噪音交易⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。一個像素的有效尺寸⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，在許多慢掃描數碼相機可以增加分箱⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，一種方法⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，其中從集群中的相鄰光電二極管的電荷匯集和處理웃유ღ♋♂，如果是來自一個更大的探測器✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。
電荷耦合器件的動態范圍
|
位深度
|
灰度
|
動態范圍
|
|
1
|
2
|
6分貝
|
|
2
|
4
|
12分貝
|
|
3
|
8
|
18分貝
|
|
4
|
16
|
24分貝
|
|
5
|
32
|
30分貝
|
|
6
|
64
|
36分貝
|
|
7
|
128
|
42分貝
|
|
8
|
256
|
48分貝
|
|
9
|
512
|
54分貝
|
|
10
|
1,024
|
60分貝
|
|
11
|
2,048
|
66分貝
|
|
12
|
4,096
|
72分貝
|
|
13
|
8,192
|
78分貝
|
|
14
|
16,384
|
84分貝
|
|
16
|
65,536
|
96分貝
|
|
18
|
262,144
|
108分貝
|
|
20
|
1,048,576
|
120分貝
|
表2
分級是有用的✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，當光線水平非常低✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，幾個光子的檢測웃유ღ♋♂，因為它使研究者交易空間分辨率靈敏度ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。此外✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，最慢掃描CCD 相機允許的感興趣區域讀出選定的圖像部分中㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，可以顯示和所積累的電荷的其余部分被丟棄웃유ღ♋♂。的劃分率一般增加成比例地減少領域的視圖⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。例如㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，有傳感器的 CCD 大小為 1000×1000 10 幀 / s ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，可以產生 100 幀 / 秒⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，如果所讀出的區域被減少到 100×100 二極管的輸出速率ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ。通過交易過場的視圖和幀速率☾☽❄☃，研究者可以調整到一個更廣泛的范圍內試驗的情況下㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，將有可能比具有固定的幀速率攝像機☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。
強化數碼相機
現在⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，一些制造商提供數碼相機配備了非常低的微光成像圖像增強⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。這些具有接近的光電陰極❣❦❧♡۵，微通道板電子倍增器和磷光發光性的輸出畫面（參見圖5 中的插圖）☈⊙☉℃℉❅。在這些設備的最新一代的光電面具有較高的量子效率（高達 50 ％）❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，在藍綠色端的頻譜ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。放大器的增益是在很寬的范圍內具有典型的最大為約 80000 的調節⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。從光電面以及從微通道板作為電子倍增噪聲降低熱噪聲的 S / N 在一個增強型 CCD 相機下面是一個緩慢的掃描 CCD ♀☿☼☀☁☂☄。強化 CCD 的分辨率取決于增壓器和 CCD 的⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，但通常是有限的增強微通道板幾何至 75 ％左右ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，單獨的 CCD ⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。
愈演愈烈的數碼相機有一個的降低動態（和intrascene 動態）范圍比較慢掃描相機✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，而且大多數是有限的 10 位分辨率☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。放大器增益可以快速和可重復地改變❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，以適應場景亮度的變化♀☿☼☀☁☂☄，從而增加在 interscene 動態范圍☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；。
事實上ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，由于圖像增強可門ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，也就是說㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，關閉或在幾納秒❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，相對明亮的物體☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，可 以可視化的“ 開 ” 的時間減少⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓。門控웃유ღ♋♂，強化數碼相機最需要的時間分辨熒光顯微鏡的應用ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，因為探測器調制高頻增益必須在光源同步㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。由于活細胞所需的低光照通量✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，增強型 CCD 相機經常研究動態事件和比率成像㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。
選擇適當的相機
沒有任何單一的檢測❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，在熒光顯微鏡將滿足所有要求✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，所以的研究者必須妥協✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅。曝光時間往往是最重要的參數㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉。當時間是形象整合⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，慢掃描CCD 相機的表現將優于強化相機在各個領域♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，在很大程度上是因為其更高的量子效率和更低的噪音㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。冷卻總是提高數碼相機的性能❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，但差異可能并不明顯웃유ღ♋♂，當積分時間為幾秒或更少的數字化深度為 8-12 位㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂。對于涉及數字反卷積的應用中ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，檢測器的選擇是水冷ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，科學級❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，慢掃描的攝像頭⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，能夠產生一個高分辨率的♀☿☼☀☁☂☄， 14-16- 位的圖像☾☽❄☃。光電二極管的尺寸事項 ; 一些 CCD 具有這么小的像素❣❦❧♡۵，可能不得不被限制①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，以避免飽和的電荷存儲阱✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，結果可能會受到影響的動態范圍和峰值的 S / N 的積分周期웃유ღ♋♂。如果被調查事件是快速的☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，但可以精確地觸發❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，然后緩慢掃描 CCD 工作在突發模式或高速模式可能是合適的ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。然而⒜⒝⒞⒟⒠⒡⒢⒣⒤，當該事件是不容易預測웃유ღ♋♂，試樣必須在低入射光通量連續監測㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，增強型 CCD 檢測器給出☾☽❄☃。出于這個原因☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，單分子熒光成像使用加強的數碼相機ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。
的顯微照片✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，圖6 給出了三重染色與一些熒光發色團的薄邊的小鼠小腸是一個組合 epi-fluorescence/phase 的對比度的圖像☈⊙☉℃℉❅。一個尼康的 Eclipse E600 ⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，類似于一個如圖 1 所示웃유ღ♋♂，利用與尼康 DXM 1200 數碼相機記錄的圖像❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，如圖 6 ❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。當彩色圖像所需的常規的組織學標本三個 CCD 攝像機是優選的一個不可分割的顏色掩模廉價的單傳感器的攝像頭ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ。高分辨率㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，單傳感器 CCD 攝像頭♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，配備了一個可拆卸的⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，紅웃유ღ♋♂，綠①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，藍❣❦❧♡۵，液晶濾波器已被證明是非常有用的明場和熒光顯微鏡웃유ღ♋♂。
前景
最近的 CMOS （互補金屬氧化物半導體）攝像頭預示著一個潛在的未來的重要作用①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，這些設備在熒光顯微鏡的性能改善❣❦❧♡۵。 CMOS 攝像頭在一個集成芯片上的格式的每個光電二極管與一個放大器和數字化⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯。其結果是成本低♀☿☼☀☁☂☄，結構緊湊웃유ღ♋♂，通用的檢測器的優點相結合的硅檢測沒有問題的電荷轉移ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ。 CMOS 傳感器允許再次操縱單個光電二極管㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，感興趣區域的讀出웃유ღ♋♂，高速采樣❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，電子快門和曝光格式的計算機界面✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥。直到最近☈⊙☉℃℉❅，他們遭受高的固定模式噪聲相關的開關和采樣文物⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，但現在正在迅速解決這些問題❣❦❧♡۵。它是可能的㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，他們將替換為在不久的將來的科學應用在數碼相機的 CCD ⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺。